?tude d'organismes

g?n?tiquement modifi?s

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Tout le monde le sait: chaque cellule de notre organisme a dans son noyau des instructions qui d?terminent son fonctionnement. Le jeu d'instructions (on parle de g?nome) est identique dans toutes les cellules, mais seules certaines d'entre elles sont ex?cut?es. Les cellules du foie, par exemple, n'expriment pas les m?mes caract?ristiques que les cellules de la peau. Le jeu d'instructions cellulaires contient toutes les informations pour qu'une cellule forme progressivement un f?tus, un nouveau-n? puis un adulte. Nous sommes tous uniques car l'ensemble des instructions qui d?termine beaucoup de nos particularit?s physiques et comportementales est l?g?rement diff?rent chez les divers individus.

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Cet extraordinaire manuel d'instructions, le g?nome, est ?crit avec quatre "lettres" de base (nucl?otides) ad?nylate (A), cytidilate (C), guanylate (G) et thymidilate (T). L'ordre de ces nucl?otides dans l'ADN code l'information g?n?tique. -tout comme l'ordre des lettres de l'alphabet donne leur sens aux mots. Chez l'homme ou chez la souris, le g?nome contient trois milliards de nucl?otides. Si l'on ?crivait les lettres qui repr?sentent les nucl?otides ? raison de 3 000 caract?res par page, il faudrait 1000 livres de 1000 pages chacun.

La mutagen?se dirig?e permet de changer sp?cifiquement une "lettre" (nucl?otide), une "phrase" (s?quence nucl?otidique) ou m?me quelques "paragraphes" (g?nes) de ce texte dans chacune des cellules d'une souris vivante. En ?valuant les cons?quences de telles modifications, nous explorons ainsi le programme g?n?tique des mammif?res. Quand nous changeons une s?quence nucl?otidique d'un g?ne, nous en perturbons la fonction. Ceci permet de conna?tre le processus biologique dans lequel le g?ne est impliqu?.

Les informations tir?es de telles exp?riences de mutation dirig?e chez la souris ?clairent la biologie humaine, car l'homme et Mickey ? heu, ? la souris partagent plus de 99 pour cent de leurs g?nes. C'est ainsi que l'on ?tudie aujourd'hui les m?canismes du d?veloppement embryonnaire humain, ainsi que la formation et le fonctionnement du syst?me immunitaire ou encore le fonctionnement du cerveau et comment se d?clenchent certaines maladies g?n?tiques. Aujourd'hui on reproduit par mutagen?se dirig?e des maladies humaines chez la souris, tels la mucoviscidose, le cancer ou l'ath?roscl?rose.

L'homme disposant d'environ 200 000 g?nes dont on ne conna?t la fonction que d'un tr?s petit nombre, il s'agit l? d'un travail de fourmi !!

Sch?ma g?ne => prot?ine mut?e => d?ficience

I. DES MUTATIONS CIBL?ES sont obtenues par insertion d'un g?ne mut? (le segment vert ? gauche du sch?ma ci-contre)

dans l'ADN d'une cellule. Le g?ne anormal remplace le g?ne original sain (le fragment orange ? droite) sur un des chromosomes. A partir des cellules dont les g?nes sont ainsi modifi?s, les g?n?ticiens produisent des souris qui portent des mutations g?n?tiques particuli?res. Dans l'une des exp?riences, le g?ne ?tudi? ?tait le g?ne int 2 : les souris qui portaient un tel g?ne mut? avaient une queue anormale, incurv?e, et des troubles de l'?quilibre (ci-dessus) ; les g?n?ticiens ont d?duit de cette exp?rience que le g?ne int 2 participe au d?veloppement de la queue et de l'oreille interne.

La mutagen?se classique a ?t? utilis?e pour ?tudier l'ADN d'un organisme unicellulaire - relativement simple ? ?tudier (une bact?rie ou une levure). Il faut selon cette technique exposer un milliard de ces cellules ? des substances mutag?nes. En choisissant la dose correcte de ces substances, on s?lectionne des bact?ries dont l'ADN qui ne se duplique plus. Comme la duplication de l'ADN est un m?canisme complexe, qui n?cessite plus d'une centaine de g?nes, il faut un nombre consid?rable cellules pour trouver tous les g?nes indispensables ? cette duplication. Une fois ces g?nes identifi?s, on pr?cise leur r?le dans la duplication de l'ADN : certains d?clenchent la r?plication de l'ADN, d'autres r?glent la vitesse du recopiage, d'autres encore contr?lent le ph?nom?ne.

Cette m?thode a ?t? appliqu?e aux organismes pluricellulaires (plus complexes); notamment la mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster. Toutefois, m?me sur ces organismes pluricellulaires relativement simples, l'identification de tous les g?nes qui participent a un m?canisme biologique pr?cis est beaucoup plus d?licate.

Une des raisons de cette difficult? est la taille du g?nome; le g?nome de la bact?rie Escherichia coli contient 3 000 g?nes, tandis que celui de la drosophile en compte plus de 20 000, et celui de la souris plus de 200 000. Plus les g?nes sont nombreux, plus les interactions entre g?nes se multiplient et plus les ?tudes g?n?tiques sont complexes. Les ?tudes de mutagen?se classique ne peuvent porter sur autant d'individus pluricellulaires qu'avec les organismes unicellulaires : on identifie ais?ment des mutants particuliers dans un population d'un milliard de bact?ries ou de levures mut?es, mais comment ?lever seulement 100 000 drosophiles ou 1 000 souris mutantes?

Aux difficult?s pratiques d'identification des g?nes et d'?tude de leur fonction s'ajoute la complexit? de la constitution du g?nome: la plupart des organismes pluricellulaires sont diplo?des. Pour cr?er des animaux homozygotes mut?s, il faut croiser des parents qui ont chacun une copie mut?e du g?ne; un quart de la prog?niture issue d'un tel croisement h?rite de deux copies mut?es du g?ne. Cette m?thode donne les animaux recherch?s, mais elle est longue.

La recombinaison homologue.

En d?pit de ces difficult?s, l'identification des mutations responsables d'anomalies est la meilleure m?thode pour identifier les m?canismes biologiques.

On commence souvent les ?tudes en inactivant le g?ne ?tudi?, afin d'?valuer les cons?quences de l'absence de la prot?ine qu'il code normalement. Parfois les prot?ines participent ? plusieurs m?canismes biologiques pour pr?ciser les fonctions du g?ne, on doit alors introduire des mutations plus subtiles, qui ne perturbent qu'un des r?les de la prot?ine. On envisage m?me d'introduire dans les g?nes un r?gulateur agissant pendant le d?veloppement embryonnaire ou postnatal de la souris. Dans un embryon de souris, par exemple. Si on inhibait un g?ne qui commande la cr?ation et le fonctionnement correct d'une s?rie de neurones, les neurones ne se formeraient pas et l'on ne pourrait pas d?terminer l'activit? de ce g?ne chez l'adulte. En revanche, ? l'aide d'un interrupteur on pourrait laisser fonctionner le g?ne pendant le d?veloppement embryonnaire, de sorte que les neurones se formeraient normalement. puis bloquer le g?ne chez l'adulte afin de d?tecter se fonction.

La micro-injection

A la fin des ann?es 1970, on commen?ait par ?tudier l'injection d'ADN dans le noyau de cellules de mammif?res ? l'aide d'aiguilles de verre extr?mement fines. Le d?placement de ces aiguilles, contr?l? au microscope, ?tait command? par des micromanipulateurs hydrauliques. La technique ?tait efficace, puisqu'on parvenait ? introduire, dans une cellule sur cinq environ, de l'ADN fonctionnel qui ?tait transmis aux cellules filles lors des divisions cellulaires.

On fut surpris d'observer que ces mol?cules s'introduisaient parfois simultan?ment au m?me endroit et dans la m?me orientation.

En 1980, Mario Capecchi demanda le financement d'un programme d'?tude des techniques de mutations cibl?es des g?nes, mais les rapporteurs rejet?rent me pro- position. perce qu'ils croyaient tr?s improbable que la s?quence d'ADN introduite trouve son homologue parmi les innombrables s?quences du g?nome.

Malgr? ce refus, il joua son va-tout, consacrant au projet refus? des fonds pr?alablement accord?s pour d'autres projets. Si l'exp?rience ?chouait le laboratoire ?tait ruin?. Heureusement elle a r?ussi et, en 1984, lors du d?p?t d'une nouvelle demande de cr?dits pour poursuivre l'?tude des mutations cibl?es, ils avaient d?j? d?montr? le faisabilit? de la m?thode, et bien des coll?gues qui avaient refus? le premier projet ont fait preuve d'humour en acceptant la demande et en concluant "Nous sommes heureux que vous n'ayez pas suivi nos conseils."

Comment r?alise-t-on des mutations dirig?es? D'abord on isole le g?ne ? ?tudier et on le multiplie ? l'aide de cultures de bact?ries. On obtient ainsi un fragment d'ADN qui contient uniquement le g?ne ?tudi?. Puis on modifie la s?quence du g?ne afin d'obtenir la mutation voulue. Ce g?ne modifi? est le vecteur de criblage. On introduit alors ce dernier dans le noyau de cellules, o? il forme un complexe avec les prot?ines de la machinerie de recombinaison homologue. Ces prot?ines l'apparient ? le s?quence homologue du g?nome et remplacent cette s?quence originale par le s?quence introduite.

La s?lection des g?nes

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Toutefois ce remplacement cibl? n'a lieu que dans une petite proportion des cellules trait?es et, le plus souvent, le vecteur de criblage s'ins?re au hasard dans le g?nome ou ne s'int?gre pas du tout; on doit donc identifier les cellules ou la recombinaison homologue a bien eu lieu une cellule sur un million environ incorpore le g?ne de remplacement au bon endroit.

La recherche des cellules modifi?es utilise des "marqueurs de s?lection", introduits dans le vecteur de ciblage. Les marqueurs "positifs" favorisent la croissance des cellules qui contiennent les vecteurs correctement plac?s dans le g?nome ou non. Au contraire, les marqueurs de s?lection "n?gatifs" favorisent l'?limination de le plupart des ccllules qui ont incorpor? le vecteur de criblage au hasard.

Le marqueur positif que l'on utilise g?n?ralement est le g?ne de r?sistance ? la n?omycine flanqu? de segments d'ADN ?galement pr?sents dans le g?ne cible. Le marqueur n?gatif, le g?ne codant le thymidine kinase du virus de l'herp?s, est plac? ? une extr?mit? du vecteur de criblage. Au cours de la recombinaison homologue, les deux segments du g?ne inject? encadrant le g?ne de r?sistance ? la n?omycine remplacent le g?ne homologue sur le chromosome cible. Le g?ne de la thymidine kinase situ? ? l'ext?rieur de la zone de recombinaison homologue n'est pas int?gr? au chromosome et il est d?grad? par 1a cellule. Cependant, lorsque le vecteur de criblage s'introduit de fa?on inappropri?e, il conserve la s?quence codant pour la thymidine kinase. Enfin lorsque l'insertion n'a pas lieu, le vecteur et les deux marqueurs sont absents.

Pour s?lectionner les cellules o? la mutation cibl?e a eu lieu, on cultive toutes les cellules dans un milieu qui contient ? la fois un analogue de la n?omycine et une substance qui d?truit le virus de l'herp?s, le ganciclovir. L'analogue de la n?omycine d?truit les cellules d?pourvues du g?ne de r?sistance ? la n?omycine, c'est-?-dire celles qui n'ont pas int?gr? l'ADN vecteur. Le ganciclovir lui, d?truit les cellules qui contiennent le g?ne du virus de l'herp?s, c'est- ?-dire celles qui ont int?gr? le vecteur au hasard. Ainsi, seules les cellules qui contiennent le "marqueur de s?lection positif" (le g?ne de r?sistance ? la n?omycine) et qui ne contiennent pas le "marqueur de s?lection n?gatif" (le g?ne du virus de l'herp?s) se multiplient.

Produisants des cellules souches o? l'une des copies d'un g?ne donn? contient une mutation particuli?re, on introduit ensuite ces cellules dans des embryons de souris qui sont ensuite r?introduits dans des souris gestantes et qui se d?veloppent jusqu'? la naissance. Quelques-unes de ces souris produisent des spermatozo?des dont le g?nome contient la mutation ?tudi?e an croisant ces souris avec des souris normales. on obtient des souriceaux h?t?rozygotes pour la mutation, c'est-?-dire dont toutes les cellules contiennent un exemplaire mut? du g?ne ?tudi?.

G?n?ralement cas animaux h?t?rozygotes se d?veloppent normalement, parce que le second exemplaire du g?ne, normal, pallie les carences du g?ne mut?. Toutefois, par le croisement d'animaux h?t?rozygotes, nous obtenons des souris homozygotes dont les deux exemplaires du g?ne ?tudi? sont mut?s. De tels animaux pr?sentent des anomalies qui r?v?lent les fonctions normales du g?ne.

Cette description rapide masque bien des difficult?s. Nous commen?ons par injecter les cellules souches modifi?es dans des embryons au stade blastocyste, c'est-?-dire avant qu'ils ne soient attach?s ? la paroi ut?rine de la m?re. Comme nous observons la couleur de la peau des nouveau-n?s pour savoir si l'exp?rience se d?roule comme pr?vu, nous choisissons des blastocystes qui se d?veloppent an souriceaux noirs tant qu'ils n'ont pas int?gr? les cellules souches modifi?es, lesquelles imposent une couleur brune.

En effet, les cellules souches sont isol?es d'une souris brune qui portent deux copies du g?ne agouti. Une seule copie de ce g?ne suffit ? produire une couleur brune parce qu'il provoque le d?p?t d'un pigment jaune pr?s du pigment noir des poils (la production des pigments eux-m?mes d?pend d'autres g?nes). Nous int?grons nos cellules souches ? des blastocystes qui donneraient normalement des souris noires (les souris acqui?rent un pelage noir lorsque le g?ne agouti h?rit? des deux parents est d?fectueux). Ensuite, nous laissons les embryons contenant les cellules souches modifi?es se d?velopper jusqu'? leur terme dans la m?re porteuse.

Quand tout se d?roule comme pr?vu, les cellules souches modifi?es se multiplient, transmettant ? leurs descendantes des copies de tous leurs g?nes. Ces cellules se m?langent ? celles de l'embryon et participent ? la formation de la plupart des tissus de la souris. Les nouveau-n?s sont des chim?res: ils sont compos?s de cellules d?riv?es des cellules souches ?trang?res et de cellules issues de l'embryon d'origine.

Sh?ma

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2. LE SOURICEAU NOUVEAU-N? repr?sent? en haut ? gauche porte une mutation sp?cifique dans ses deux exemplaires du g?ne HoxA 3, Son corps est plus courb? que celui d'un souriceau normal (le second en partant de ta gauche). En comparant des coupes de tissus de souris mutantes (au centre droit) et normales (? l'extr?me droite), on constate que de tels mutants n'ont pus de thymus et que leur glande thyro?de est anormalement petite. Ces anomalies montrent que le g?ne HoxA 3 est indispensable au d?veloppement des tissus et des organes qui proviennent d'une bande ?troite de cellules (en couleur sur le sch?ma ci-contre) pr?sente dans les tout jeunes embryons.

Nous reconnaissons les embryons chim?riques aux taches brunes qui pars?ment leur pelage noir. Quand un souriceau a un pelage compl?tement noir, c'est qu'il ne contient pas de g?ne agouti, donc pas de cellules d?riv?es des cellules souches modifi?es.

En se contentant d'observer ces chim?res, on ne sait pas si les cellules souches ont form? des cellules germinales. qui transmettent la mutation dirig?e aux g?n?rations ult?rieures. Aussi devons-nous produire des souris h?t?rozygotes qui contiennent une copie de la mutation dans toutes leurs cellules nous croisons les souris chim?riques m?les avec des femelles d?pourvues du g?ne agoitti. Les jeunes issus de ce croisement sont bruns si le spermatozo?de dont ils sont issus provient d'une cellule souche modifi?e (parce que de tels spermatozo?des portent un g?ne agouti); en revanche, ils sont noirs si le spermatozo?de dont ils sont issus provient de l'embryon receveur.

Ainsi nous savons que les souriceaux bruns de seconde g?n?ration portent les g?nes des cellules souches modifi?es. En croisant ces souris brunes, une fois adultes, avec des souris h?t?rozygotes de la m?me port?e, on obtient des souris qui portent deux exemplaires mut?s du g?ne ?tudi?. Afin de ne croiser que des souriceaux bruns, qui ont effectivement un exemplaire mut? de ce g?ne, nous devons identifier les h?t?rozygotes qui ont un exemplaire du g?ne mut? : nous examinons directement leur ADN. Puis, chez les animaux homozygotes. nous analysons les anomalies anatomiques. physiologiques ou comportementales.

Embryogen?se et maladies g?n?tiques
Si l'?tude des g?ne s hom?otiques de la drosophile a fait notablement progresser l'embryologie (voir Les g?nes du d?veloppement, par William MacGinnis et Michael Kuziora, Pour la Science, avril 1994), de nombreuses questions subsistent pourquoi la drosophile a-t-elle seulement huit g?nes Fox, tandis que les souris et les hommes en ont ? 38? La multiplication des g?nes Fox a-t-elle jou? un r?le au cours du passage des invert?br?s aux vert?br?s en fournissant une machinerie suppl?mentaire n?cessaire aux organismes complexes? Quelles sont les fonctions pr?cises de ces 38 g?nes?

Avant la d?couverte de la m?thode des mutations dirig?es, on ne pouvait r?pondre ? aucune de ces questions, car on ne disposait d'aucune souris pr?sentant une mutation d'un g?ne Hox. Aujourd'hui nous cherchons ? ?tablir syst?matiquement la fonction de tous les g?nes Fox, dans le dessein de pr?ciser ult?rieurement le r?seau des interactions qui commandent le d?veloppement des organismes.

L'inhibition sp?cifique du st?ne HoxA 3 semble avoir plusieurs cons?quences n?fastes. Les souris dont les deux copies de ce g?ne sont mut?es meurent ? la naissance, parce que leur appareil cardio-vasculaire est incompl?tement d?velopp? et d?ficient. Plusieurs autres tissus et organes sont ?galement anormaux: le thymus, les glandes thyro?de et parathyro?de. les os, les cartilages de la r?gion inf?rieure de la t?te, ainsi que les tissus conjonctifs, les muscles et les cartilages de la gorge.

En th?orie, la m?thode des mutations dirig?es devrait affiner la m?thode d'insertion des g?nes de remplacement. Toutefois, avant de l'utiliser pour corriger un g?ne d?fectueux, ceux dans les tissus atteints d'un patient, les g?n?ticiens devront obtenir des cultures de cellules capables de participer ? la formation de ces tissus chez l'adulte. De telles cellules souches sont pr?sentes dans la moelle osseuse, dans les poumons, dans la peau, dans les intestins et dans divers tissus, mais on ne sait pas encore les isoler ni les cultiver.

La m?thode des mutations dirig?es sera certainement perfectionn?e, mais elle permet d?j? de manipuler le g?nome des mammif?res d'une fa?on que l'on n'aurait pu imaginer il y a seulement quelques ann?es. La m?thode des mutations dirig?e augmente les possibilit?s du g?nie g?n?tique, dont les limites sont aujourd'hui surtout d'ordre intellectuel.

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Le Moteur Recherche-Web ?

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